产品概况

        如何制备出具有可控性和重复性的微环境，以便更有效的研究活细胞和疾病模型，一直是生物学家进行体外细胞研究所面临的巨大挑战之一。

        法国Alvéole的PRIMO是创新性定制细胞模型的工具，能在微米级别的尺度下，用非接触、无掩膜的光学蚀刻方法制备细胞模型、以具有超高灵活度和再现性的生物工程手段实现体外微环境的定制，同时可对其机械力学和生化特性进行设计微调，具有高度的灵活性、可控性和可重复性。选择电脑中任意一张图案，PRIMO都能将它投射到细胞培养基质上，利用非接触式、无掩模的光刻技术，在软件和光敏试剂的帮助下获得任意图案的2D蛋白涂层或3D水凝胶或微流控结构。

        目前PRIMO 定制化生物建模及微环境制备系统在全球用户110+。

产品原理

法国Alvéole的PRIMO工作原理（三种设计方法）：

1、第一种设计：基质的表面功能化，即Micropatterning。

先在基质上包裹一层防污涂层（antifouling layer），一般是高分子聚合物如PEG，阻碍蛋白质粘附。选择电脑中任意一张图案，在LEONARDO软件作用下，PRIMO都能利用非接触式、无掩模的光刻技术，用UV光通过显微镜将它投射到细胞基质上，在PLPP光敏引发剂帮助下，防污涂层被降解，蚀刻出微图案，蛋白可粘附在蚀刻出的微图案上，细胞粘附在蛋白上，可适应于基质上定制的生物化学、表面形貌和硬度等特征，形成定制的细胞模型。适用于细胞微环境研究。

2、第二种设计：水凝胶的结构化，即Structuration of Hydrogel。

在氧气不足的条件下，UV光照射，可使水凝胶固化；水凝胶固化的高度随UV照射强度增加而增加。我们结合UV-图像照射和气体可渗透的微反应器，可获得4种水凝胶的工程方法：完全多聚化（total polymerization）、Z轴控制的多聚化（z-controlled polymerization）、光剪切（photo-scission）和修饰（decoration）。单独应用或结合应用就可以解决水凝胶工程化问题。适用于3D细胞培养。

3、第三种设计：微制造，即Microfabrication。

用UV光固化感光树脂/光刻胶（photoresist），再用PDMS（聚二甲硅氧烷）在固化的感光树脂/光刻胶上倒模，形成带有微结构的PDMS芯片。适用于制造微流控芯片。

4、复杂的表面功能化或其他

可以结合以上几种方法进行复杂的细胞微环境构建。

产品特点

1、步骤简单：四步可完成：计算机图案设计、用UV光蚀刻构建基质结构、种蛋白进行基质功能化、将细胞接种到定制好的微环境中。

2、高灵活性：可按照任意图案去构建基质和/或使其功能化，不限图案的大小和复杂程度，只需软件操作即可灵活改变图案，从而生成不同的细胞模型。

3、非接触式、无掩模UV投射：可灵活控制UV的照射强度、照射时间和照射区域对基质进行蚀刻、切割和固化。可以实时观看蚀刻过程，及时调整和优化实验条件。

4、适用于多种基质：用户可以使用任意一个常规的细胞基质：可以是扁平的，也可以是带有微结构的，可以是坚硬的也可以是柔软的，如：玻璃盖玻片、塑料培养皿、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚苯乙烯、水凝胶（PEG丙烯酸酯、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂、基质胶）、光刻胶，等。

5、适合多种蛋白：PRIMO的客户日常使用超过10种的各类蛋白：Fibrinogen-488, Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647, PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体，等。

6、蚀刻高分辨率：全视野分辨率为1.2µm（ 500×300µm ，20倍物镜）。

7、多层次：可蚀刻256个灰阶层次，粘附不同密度层次的蛋白。

8、多种蛋白：可应用3种不同蛋白（根据实验需求），可从用户日常使用的10多种蛋白质中选取。

9、自动对齐：自动进行检测和图案定位，如自动对齐于微结构或者微图案上。

10、蚀刻速度快：完成整个视野中的图案（500×300µm，20倍物镜），仅需0.5s。

产品应用

适用于所有研究细胞与微环境作用的领域。如：

1、2D细胞微环境建构，研究如细胞迁移/趋触性、细胞黏附、细胞力学、细胞标准化培养、电镜的标准化细胞观察等。

2、3D细胞微环境建构，研究如细胞球培养、类器官、组织工程等。

3、微流体芯片制作，研究如类器官芯片、细胞流体力学研究、小分子扩散研究等。

类器官应用：

1、 PRIMO可以通过水凝胶结构化创建具有3D支撑作用的基质结构，再加上类器官发育所必需的各种细胞生长因子，将多能诱导干细胞或胚胎干细胞培养形成具有三维立体结构的各种类器官进行功能性研究。

2、 PRIMO可以将来自于患者的原代肿瘤细胞培养成更接近于体内形态的肿瘤球，进行抗肿瘤药理实验。

3、 PRIMO还可以通过构建类器官芯片，创造3D微结构，进行多种细胞的共培养，在体外模拟多个细胞相互作用的体内运行。

1、研究细胞间作用力

下图：研究基质的刚性如何影响平滑肌（ASM）细胞间的力的传导模式，用PRIMO设计了一个长方形结构，将两个ASM细胞组合在一起。

PRIMO作用：在聚二甲基硅氧烷（PDMS）软基质上进行Micropatterning设计，粘附明胶模拟ECM蛋白，再种上ASM细胞创建两个平滑肌细胞的作用力模型，通过牵引力显微镜研究基质的刚性如何影响平滑肌细胞间的力的传导模式。这个实验的特别之处在于，不只是描述了作用力的变化，也验证到了细胞生物学上一些蛋白的表达量，它把这两者关联了起来。

2、研究心肌细胞收缩

下图：左列图：心肌细胞在玻璃培养皿上的收缩；中列图：沿着小箭头方向收缩；右列图：收缩力的显示

PRIMO作用：将细胞组成不同的图像：四方形、长条形，等。组成图像的心肌细胞的力学输出增加，微图像促进了协作的心肌细胞的收缩。

3、研究细胞迁移

下图：对细胞的约束力变化模拟前端细胞/后端细胞的迁移，研究细胞形态和迁移速度如何受到细胞侧向限制的影响。

PRIMO作用：用微通道对细胞进行侧向限制，对细胞施加不同的限制力，这种限制作用可调节三维的细胞形态并影响细胞迁移速度。用来模拟上皮组织中 follower cell 受到的空间限制作用，PRIMO可创建微通道并加速设计过程。

4、研究细胞的趋触性

下图：研究不同粘度的基质诱导T细胞的趋触性：在不同的粘附条件下，T细胞在ICAM-1基质上的运动轨迹。

下图：在不同的粘附条件下，T细胞在ICAM-1基质上的迁移特性。

PRIMO作用：用Micropatterning方法在ICAM-1基质上创造出不同浓度的整联蛋白的条带，改变ICAM-1基质的粘附性，观察细胞在条带上的迁移（趋触性）。

5、制备冷冻电镜标准化细胞样本

下图：左图：细胞在传统电镜网格中的定位，可见用传统方法大多数细胞都粘附在网格的框架上，只有少数细胞有较好的定位（红圈/箭头表示）。右图：细胞在PRIMO处理过的网格中的定位，可见在PRIMO处理过的网格中，所有细胞都定位在网眼的正中央（红色方框）。

PRIMO作用：为冷冻电镜提供更好的细胞样本：精准的自动化细胞定位、优化的细胞伸展、标准化微图案设计、电镜网格表面无损伤、高产低耗。

6、非粘附性基质的细胞球标准化培养

下图：上图：光聚合的PEG水凝胶（4-arm-PEG-acryl hydrogel）槽内的HEK细胞球。

下左图，下中图：共聚焦荧光显微图像，PEG水凝胶槽内的小球体和双球体。

PRIMO作用：细胞球是细胞的聚集，可以作为生理模型或复杂类器官的起始模型。非粘附性水凝胶基质固化形成微孔，细胞种植其中形成细胞球，可形成多种细胞共培养、由多种蛋白调控的3D组织类器官模型。

7、粘附性基质的细胞培养

下图：PEG水凝胶通过聚合形成特定形状，然后用交联分子的方法进行装饰，允许COS-7细胞在这些结构中生长，以模拟毛细血管（上图）和小肠绒毛（下图）。中列：Z轴颜色编码的共聚焦荧光显微镜图像，显示COS-7细胞种植在凝胶上，肌动蛋白染色。右列：Z轴用3色最大化投影显示的共聚焦荧光显微图像，显示纤连蛋白（红色），肌动蛋白细胞骨架（绿色）和核膜（蓝色）。

PRIMO作用：混合其他水凝胶，形成粘附性基质，通过光固化和光剪切，使UV敏感的水凝胶形成特定形状，表面进行功能化，再种植细胞。

8、修饰水凝胶结构

下图：修饰水凝胶结构的原理示意图

下图：蓝色为水凝胶，红色为黏附的纤维连接蛋白（fibronectin）。中间和右侧为共聚焦图像。

PRIMO的作用：混合惰性水凝胶和其他水凝胶，形成粘附性基质，或改造惰性水凝胶成为粘附性基质，再通过光固化和光剪切，使UV敏感的水凝胶形成特定形状，表面进行功能化，再种植细胞，可创造不同的细胞模型，可形成以水凝胶为骨架，多种细胞共培养、由多种蛋白调控的3D组织类器官模型。

9、用微制造设计“类器官芯片”（微流控芯片）

下图：用微制造（Microfabrication）设计“类器官芯片”（微流控芯片），研究者将不同类型的细胞注射到芯片的不同的腔室/管道里，以重现造血干细胞的微生态环境：顶部腔室里的成骨细胞模拟骨骼成分，底部腔室里的HUVEC细胞模拟血管成分，造血干细胞被注射进入中间的通道。

PRIMO作用：设计“类器官芯片”，创造共培养微环境，在体外模拟多个细胞相互作用的体内运行。